Teodor Lektor (VI wiek) podaje, że ewangelista namalował obraz przedstawiający Matkę Bożą, który zabrała potem z Jerozolimy Eudoksja, żona cesarza Teodozjusza II. Od tego czasu autorstwo św. Łukasza przypisywano wielu ikonom. Dlatego często przedstawiano na obrazach świętego, jak maluje pozującą mu Madonnę.

Portret Maryi powstaje w mieszkaniu Świętej Rodziny. Z lewej strony widzimy pracującego świętego Józefa, który z zainteresowaniem spogląda na malarza i pozującą mu małżonkę. Łukaszowi towarzyszy widoczny przy sztalugach wół – jego atrybut jako ewangelisty. Zarówno Matka Boża, jak i Dzieciątko mają w rękach winogrona – symboliczną zapowiedź późniejszego ustanowienia Eucharystii. Jezus podaje winogrona świętemu malarzowi, co podkreśla fakt, że Eucharystia jest Jego darem dla ludzi. Z prawej strony, za plecami Maryi, znajduje się otwarta księga Pisma Świętego. To sugestia artysty, że malowany przez ewangelistę portret jest przedstawieniem w innej formie tego, co napisał w Ewangelii. Obok stoi globus, symbolizujący panowanie Chrystusa nad światem. Z góry całej scenie przyglądają się pląsające w chmurze aniołki, trzymające kwiatki o maryjnej symbolice.

Twórca tego obrazu, Marten de Vos, był w młodości luteraninem. Nawrócił się jednak na katolicyzm i stał się gorliwym czcicielem zarówno Maryi, jak i św. Łukasza. W bractwie św. Łukasza w Antwerpii od 1571 roku pełnił nawet funkcję diakona. Obraz „Św. Łukasz malujący Madonnę” jest jego ostatnim wielkim dziełem, stworzonym na rok przed śmiercią.